Caracterização de alterações epigenéticas no gene JARID1C e desequilíbrios genéticos como causas do retardo mental ligado ao x de etiologia idiopática

O retardo mental (RM) é caracterizado por um funcionamento intelectual significantemente abaixo da média (QI<70). A prevalência de RM varia entre estudos epidemiológicos, sendo estimada em 2-3% da população mundial, constituindo assim, um dos mais importantes problemas de saúde pública. Há um consenso geral de que o RM é mais comum no sexo masculino, um achado atribuído às numerosas mutações nos genes encontrados no cromossomo X, levando ao retardo mental ligado ao X (RMLX). Dentre os genes presentes no cromossomo X, o Jumonji AT-rich interactive domain IC (JARID1C) foi recentemente identificado como um potencial candidato etiológico do RM, quando mutado. O JARID1C codifica uma proteína que atua como uma desmetilase da lisina 4 da histona H3 (H3K4), imprescindível para a regulação epigenética. Tão recente como a identificação do gene JARID1C, é a descoberta de que mudanças no número de cópias de sequências de DNA, caracterizadas por microdeleções e microduplicações, poderiam ser consideradas como razões funcionalmente importantes de RMLX. Atualmente, cerca de 5-10% dos casos de RM em homens são reconhecidos por ocorrerem devido a estas variações do número de cópias no cromossomo X. Neste estudo, investigamos mutações no gene JARID1C, através do rastreamento dos éxons 9, 11, 12, 13, 15 e 16, em 121 homens de famílias com RM provavelmente ligado ao X. Paralelamente, realizamos a análise da variação do número de cópias em 16 genes localizados no cromossomo X através da técnica de MLPA no mesmo grupo de pacientes. Esta metodologia consiste em uma amplificação múltipla que detecta variações no número de cópias de até 50 sequências diferentes de DNA genômico, sendo capaz de distinguir sequências que diferem em apenas um nucleotídeo. O DNA genômico foi extraído a partir de sangue periférico e as amostras foram amplificadas pela técnica de PCR, seguida da análise por sequenciamento direto. Foram identificadas três variantes na sequência do gene JARID1C entre os pacientes analisados: a variante intrônica 2243+11 G>T, que esteve presente em 67% dos pacientes, a variante silenciosa c.1794C>G e a mutação inédita nonsense c.2172C>A, ambas presentes em 0,82% dos indivíduos investigados. A análise através do MLPA revelou uma duplicação em um dos pacientes envolvendo as sondas referentes ao gene GDI1 e ao gene HUWE1. Este trabalho expande o estudo de mutações no gene JARID1C para a população brasileira ereforça a importância da triagem de mutações neste gene em homens portadores de RM familiar de origem idiopática, assim como, é primeiro relato científico relativo à investigação de variações no número de cópias de genes localizados no cromossomo X em homens brasileiros com RM, através da técnica de MLPA.

Evidencia de la presencia de histonas en trofozoitos de Entomoeba invadens

Tesis (Maestra en ciencias con especialidad en biología celular) U.A.N.L.

Efeitos da tricostatina A sobre a acetilação de histonas, proliferação celular e diferenciação de células tronco embrionárias murinas

Background: Embryonic stem cells are cells derived from early-stage embryos that are characterized by pluripotency and self-renewal capacity. The in vitro cultured murine embryonic stem cells can indefinitely propagate in an undifferentiated state in the presence of leukemia inhibitory factor (LIF). However, when stimulated, these cells can differentiate into cell lines derived from all three embryonic germ layers. The trichostatin A (TSA) is an epigenetic modifier agent and several studies have used the TSA to stimulate cellular differentiation. However, most of these studies only assessed one TSA concentration. Therefore, this study aimed to evaluate the effects of different TSA concentrations on histone hyperacetylation during in vitro cell differentiation of murine pluripotent embryonic stem cells, cultured with or without LIF, in the quest of to standardize their application on early cultures of embryonic stem cells.Materials, Methods & Results: Undifferentiated murine embryonic stem cells were plated in the presence of different TSA concentrations (0 nM, 15 nm, 50 nM and 100 nM) in the presence or absence of LIF. Thus, the treatments were evaluated in undifferentiated embryonic stem cells cultured in the presence of LIF (Control group: 0 nM LIF(+); Group 15 nM LIF+; Group 50 nM LIF+ and Group 100 nM LIF+), and in embryonic stem cells cultured in the absence of LIF (Control group: 0 nM LIF; Group 15 nM LIF(-); Group 50 nM LIF(-) and Group 100 nM LIF-). Treatment with TSA was performed for 24 h. After that the medium was replaced with fresh medium without TSA. Samples were collected at 0, 12, 24, 36 and 48 h after the beginning of the experiment. Three replicates were performed in each experimental group. The relative amount of Histone H3 lysine 9 acetylation was analyzed in all groups, as well as the cell proliferation in the embryonic stem cells cultured in the presence of LIF. In the control group (0 nM), the absence of LIF resulted in higher levels (P < 0.05) of H3lys9ac compared to the cultures supplemented with LIF. In the embryonic stem cells cultured in the presence of LIF, the 50 nM and 100 nM treatments resulted in higher levels (P < 0.05) of H3lys9ac when compared with 0 nM and 15 nM treatments. Evaluating the Hoechst area in the 0 nM group, it was observed that the number of cells increased (P < 0.05) according to the time of culture. Treatment with 15 nM also reflected a similar distribution, but the Hoechst area in 15 nM group was lower (P < 0.05) at 24 and 48h when compared to the observed in the control group. In the 100 nM treatment, was observed that the area of Hoechst was lower (P < 0.05) to that obtained in the control group at 12, 24 and 48h. In addition, it was observed that treatment with TSA induces greater cellular differentiation when compared to control groups in stem cells cultured in the presence of LIF as well as in the absence of LIF.Discussion: In the present study it was observed that TSA treatment increased the levels of histone acetylation in murine embryonic stem cells at a 50 nM concentration, making it possible to reduce the concentration recommended in the literature (100 nM). In addtion, it was concluded that the lower TSA concentrations utilized (15 nm and 50 nM) was less harmful to cellular proliferation than the 100 nM TSA concentration.

Efeito das condições de cultivo no remodelamento das histonas de embriões bovinos produzidos in vitro

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FCAV

Efeitos da hiperaceleração de histonas na diferenciação in vitro de células tronco embrionárias murinas

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efeitos do exercício voluntario na recuperação de hemissecção da medula espinhal: mudanças na rede perineuronal e acetilação de histonas

A prática regular de exercícios físicos previne e combate várias doenças ao longo do tempo, destacando-se como excelente ferramenta terapêutica para o tratamento de lesões no sistema nervoso central (SNC). Após uma transecção (completa ou incompleta/hemissecção) da medula espinhal, células gliais reativas secretam substâncias inibitórias à regeneração axonal como, por exemplo, as moléculas de proteoglicanas de sulfato de condroitina (PGSCs) que exercem papel importante na formação de uma barreira físico-química, chamada cicatriz glial, que impede o crescimento dos axônios danificados pela lesão. Pesquisas que envolvem modelo experimental de lesão da medula espinhal e reabilitação por exercício físico têm obtido promissores resultados. No entanto, os mecanismos fisiológicos e moleculares pelos quais promovem esses resultados positivos ainda são pouco conhecidos. O objetivo do presente trabalho foi analisar a recuperação da função motora da pata posterior após protocolo de exercício físico voluntario em modelo experimental de hemissecção da medula espinhal e investigar dois mecanismos moleculares envolvidos na recuperação funcional: a degradação de PGSCs nas redes perineuronais e acetilação de histonas. Para isso, vinte e quatro (24) ratos da linhagem Wistar (Rattus novergicus) foram utilizados e separados em 3 grupos (controle, treinados e não treinados). Com exceção do grupo controle, todos os animais foram habituados a rodas de corridas e em seguidas foram submetidos a uma cirurgia experimental de hemissecção da medula espinhal, na altura da 8a vertebra torácica. Nossos resultados demonstraram que o exercício voluntário em rodas de corrida após lesão experimental da medula espinhal promoveu recuperação da função motora da pata posterior afetada, porém não observamos diferenças qualitativas na acetilação de histonas e degradação de PGSCs entre os grupos.

Origens dos cromossomos B em espécies de Characidium (Characiformes, Crenuchidae) baseada em pintura cromossômica, sequências de rDNA e histonas

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Genética) - IBB

New Oncogenic Drivers in Hepatocellular Carcinoma: Role of the RNA Binding Protein Hu antigen R

156 p. : graf.

Estudio comparativo entre tumor primario y metastásico de la trimetilación de la Histona H3 en el modelo in vivo de metástasis hepática de cáncer colorrectal murino.

Los mecanismos epigenéticos, entre los que está implicada la modificación covalente de histonas, son esenciales para el mantenimiento estable de la actividad génica en las células. Estos mecanismos también están implicados en la aparición de enfermedades como el cáncer colorrectal (CCR), siendo la metástasis hepática una de las formas más agresivas de la misma al producir una drástica disminución de la esperanza de vida del enfermo. Las modificaciones en las histonas, conocidas recientemente como código histónico, afectan a la estructura de la cromatina y juegan un papel importante en el desarrollo de la tumorogénesis. Sin embargo, se sabe poco acerca de aquellas células que adquieren la capacidad de metastatizar, y es por ello que en el presente trabajo se estudian las diferencias epigenéticas entre células tumorales primarias y células tumorales metastásicas para el patrón de trimetilación de la histona H3 en tres residuos diferentes del aminoácido lisina: lisina 4 (H3K4me3), lisina 9 (H3K9me3) y lisina 27 (H3K27me3).

Complejos proteicos elipsoidales NP: Octámero y su relación con el ensamblaje de nucleosomas

Se caracterizan los complejos entre la nucleoplasmina, una chaperona nuclear, y el octámero de histonas y se ve su papel en el ensamblaje de nucleosomas.

Avaliação do efeito do inibidor de histona deacetilase Panobinostat (LBH589) no metabolismo energético de células derivadas de câncer de pulmão

Os mecanismos de ação citotóxica do inibidor de histona deacetilase LBH589 foram investigados em associação com o quimioterápico cisplatina (CDDP) em duas linhagens derivadas de câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC). Os resultados foram analisados em relação ao tipo de morte celular associada às alterações em enzimas relacionadas ao metabolismo energético e a via glicolítica. Para realização do trabalho, foram utilizadas as linhagens tumorais A549 (selvagem para o gene de p53) e Calu-1 (nulo para o gene de p53) tratadas com LBH589 em combinação ou não com CDDP. Foram realizadas curvas de tempo e dose-resposta com as drogas isoladamente pelo ensaio de viabilidade celular (MTT) nas duas linhagens para a escolha das melhores condições para o nosso estudo. As condições dos tratamentos isolados com redução da viabilida celular menores que o IC50 de cada fármaco foram selecionados para realização dos tratamentos combinados. As avaliações de apoptose foram realizadas por citometria de fluxo pelo ensaio de Anexina V/PI, e com a marcação de proteínas por Western Blotting. As proteínas relacionadas a via glicolítica foram avaliadas por Western Blotting e a expressão de RNAm por qPCR. Os resultados demonstraram que o LBH589 combinado a CDDP foi capaz de induzir apoptose em 70% das células (Calu-1) e 54,9% (A549) no tempo de 24 horas, e 90% (calu-1) e 62,1% (A549) em 48 horas, independendo, portanto, do status da p53. Os níveis de expressão de enzimas relacionadas com o metabolismos energético também sofreram alterações nos tratamentos estudados. O LBH589 induziu aumento de cerca de 4x dos níveis de RNAm de HK isoformas I e II em ambas as linhagens. Houve também um aumento na expressão proteica das isoformas de HK I e II. Outras enzimas relacionadas a via glicolítica como PFKP, PKM2 e LDHA foram analisadas e apresentaram redução da expressão proteica, principalmente na presença do LBH589. A combinação da CDDP com LBH589 parece ser promissora para o tratamento de CPNPC induzindo apoptose através de alterações no metabolismo energético tumoral.

Fármacos que têm por alvo o epigenoma

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Caracterização e transformação de Lenhosulfonatos de Eucalyptus globulus

Os lenhosulfonatos representam um sub-produto formado durante o cozimento ao sulfito ácido, sendo queimados para a regeneração da base e recuperação de energia. No entanto, os lenhosulfonatos são também considerados uma importante matéria-prima para a produção de vários produtos de valor acrescentado. Os objectivos principais deste trabalho foram contribuir para uma melhor compreensão sobre a caracterização química e estrutural dos lenhosulfonatos do Eucalyptus globulus, assim como, para complementar a informação disponível sobre a síntese e a caracterização estrutural e térmica de materiais poliméricos obtidos a partir de compostos modelo dos produtos de oxidação dos lenhosulfonatos. O licor de cozimento ao sulfito foi analisado em termos do teor de cinzas, extractáveis, compostos voláteis, açúcares e lenhosulfonatos. O teor de cinzas e açúcares no licor de cozimento é muito elevado, tendo sido necessário purificar o mesmo (2,8-13,8 % e 3,2-9,1 %, respectivamente). A análise dos açúcares mostrou uma quantidade considerável de pentoses, sendo o açúcar predominante a xilose. Os lenhosulfonatos foram purificados, isolados e caracterizados por química molhada (titulação potenciométrica e oxidação com permanganato), análise elementar, espectroscopia de ultravioleta/visível (UV/Vis), espectroscopia de infravermelho de transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão (RMN de 1H) e carbono (RMN de 13C), espectrometria de massa de ionização por electrospray (ESI-MS), cromatografia de permeação em gel (GPC), termogavimetria (TGA) e calorimetria diferencial de varrimento (DSC). Os lenhosulfonatos são constituídos principalmente por unidades S, são parcialmente sulfonados e possuem um peso molecular relativamente baixo (Mw = 1250-2400 Da). A ruptura das ligações β-O-4 e α-O-4 da lenhina do Eucalyptus globulus após cozimento ao sulfito ácido originam olígomeros de baixo peso molecular cuja estrutura foi elucidada por RMN 1D/2D e ESI-MS. A degradação térmica dos lenhosulfonatos apresentou dois máximos de degradação a 188-190ºC e a 315-380ºC. As curvas de DSC mostraram um pico endotérmico para temperaturas inferiores a 130ºC e um pico exotérmico a 300-500ºC. Os lenhosulfonatos foram despolimerizados na presença de oxigénio molecular em meio alcalino. Os produtos de oxidação principais foram o aldeído siríngico, a vanilina, o ácido vanílico e o ácido siríngico. A adição do catalisador (sal de cobre) promoveu a oxidação dos lenhosulfonatos aumentando o rendimento dos aldeídos aromáticos (< 50%). A presença de açúcares nos lenhosulfonatos teve um efeito negativo no rendimento dos produtos de oxidação principais. Alguns compostos modelo dos produtos de oxidação dos lenhosulfonatos foram polimerizados por poliadição (catiónica e radicalar) e policondensação. Os monómeros e os polímeros foram caracterizados por espectroscopia de infravermelho de transformada de Fourier e reflectância total atenuada (FTIR-ATR), RMN em solução e no estado sólido, UV/Vis no estado sólido, GPC, difracção de raios-X (XRD), TGA e DSC. Os compostos modelo estudados foram os estirenos metoxi-substituídos (p-metoxiestireno e 3,4-dimetoxiestireno) e os ácidos hidroxi aromáticos metoxi-substituídos (ácido vanílico e ácido siríngico). O 3,4-dimetoxiestireno foi ainda copolimerizado com o éter isobutil vinílico e os seus copolímeros foram desmetilados, assim como, o poli(p-metoxiestireno) e o poli(3,4-dimetoxiestireno). A polimerização catiónica do p-metoxiestireno e 3,4-dimetoxiestireno é mais rápida e mais completa do que a polimerização radicalar produzindo polímeros com pesos moleculares elevados. O poli(p-metoxiestireno) (Mw = 235000 Da) possui um peso molecular maior do que o poli(3,4-dimetoxiestireno) (Mw = 18800 Da). A estabilidade térmica e a temperatura de transição vítrea diminuiram com a presença do segundo grupo metoxilo. A desmetilação dos homopolímeros foi bem sucedida, tendo sido corroborada por FTIR-ATR e RMN. A policondensação do ácido siríngico foi dificultada pela presença do segundo grupo metoxilo, tendo sido necessário adicionar uma maior quantidade do agente de condensação devido a factores estéricos. O poli(ácido vanílico) e poli(ácido siríngico) são insolúveis na maior parte dos solventes orgânicos, sendo parcialmente solúveis em clorofórmio, ácido triflúoracético, 1,1,2,2- tetracloroetano, dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, N,N’-dimetilformamida e 1,1,1,3,3,3-hexaflúor-2-propanol. A estabilidade térmica diminuiu com a presença do segundo grupo metoxilo e os dois polímeros não exibiram temperatura de transição vítrea. O poli(ácido vanílico) e poli(ácido siríngico) apresentaram uma estrutura muito cristalina (grau de cristalinidade 70% e 50%, respectivamente). O segundo grupo metoxilo aumentou o valor da absorvância, mas a forma do espectro de UV/Vis foi similar. A polimerização catiónica do éter isobutil vinílico resultou na produção de um polímero muito viscoso com peso molecular elevado (Mw = 20400 Da). A degradação térmica do polímero ocorreu em várias gamas de temperatura e foi completa (0% de resíduo a 800ºC). A copolimerização catiónica do 3,4-dimetoxiestireno com o éter isobutil vinílico foi realizada com proporções diferentes 80:20, 50:50 e 20:80. Os copolímeros apresentaram uma viscosidade elevada e um peso molecular baixo (Mw = 2000-4000 Da) que aumentou com a quantidade de éter isobutil vinílico. A degradação térmica dos copolímeros ocorreu também em várias gamas de temperatura, sendo a sua degradação completa (0,9-1,5% de resíduo a 800ºC). A desmetilação dos copolímeros não foi bem sucedida, tendo sido confirmada por FTIR-ATR e RMN.

Study of oxidation and non-enzymatic glycosylation posttranslational modifications using a proteomic approach

A glicosilação não-enzimática e o stress oxidativo representam dois processos importantes visto desempenharem um papel importante no que respeita às complicações de vários processos patofisiológicos. No presente, a associação entre a glicosilação não-enzimática e a oxidação de proteínas é reconhecida como sendo um dos principais responsáveis pela acumulação de proteínas não-funcionais que, por sua vez, promove uma contínua sensibilização para um aumento do stress oxidativo ao nível celular. Embora esteja disponível bastante informação no que respeita aos dois processos e suas consequências ao nível estrutural e funcional, permanecem questões por esclarecer acerca do que se desenvolve ao nível molecular. Com o objectivo de contribuir para uma melhor compreensão da relação entre a glicosilação não-enzimática e a oxidação, proteínas modelo (albumina, insulina e histonas H2B e H1) foram submetidas a sistemas in vitro de glicosilação não-enzimática e oxidação em condições controladas e durante um período de tempo específico. A identificação dos locais de glicosilação e oxidação foi realizada através de uma abordagem proteómica, na qual após digestão enzimática se procedeu à análise por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa tandem (MALDI-TOF/TOF). Esta abordagem permitiu a obtenção de elevadas taxas de cobertura das sequências proteicas, permitindo a identificação dos locais preferenciais de glicosilação e oxidação nas diferentes proteínas estudadas. Como esperado, os resíduos de lisina foram os preferencialmente glicosilados. No que respeita à oxidação, além das modificações envolvendo hidroxilações e adições de oxigénio, foram identificadas deamidações, carbamilações e conversões oxidativas específicas de vários aminoácidos. No geral, os resíduos mais afectados pela oxidação foram os resíduos de cisteína, metionina, triptofano, tirosina, prolina, lisina e fenilalanina. Ao longo do período de tempo estudado, os resultados indicaram que a oxidação teve início em zonas expostas da proteína e/ou localizadas na vizinhança de resíduos de cisteína e metionina, ao invés de exibir um comportamente aleatório, ocorrendo de uma forma nãolinear por sua vez dependente da estabilidade conformacional da proteína. O estudo ao longo do tempo mostrou igualmente que, no caso das proteínas préglicosiladas, a oxidação das mesmas ocorreu de forma mais rápida e acentuada, sugerindo que as alterações estruturais induzidas pela glicosilação promovem um estado pro-oxidativo. No caso das proteínas pré-glicosiladas e oxidadas, foi identificado um maior número de modificações oxidativas assim como de resíduos modificados na vizinhança de resíduos glicosilados. Com esta abordagem é realizada uma importante contribuição na investigação das consequências do dano ‘glico-oxidativo’ em proteínas ao nível molecular através da combinação da espectrometria de massa e da bioinformática.

Identification of protein complexes in Alzheimer's disease

A Doença de Alzheimer (AD) é a maior doença neurodegenerativa a nível mundial, e a principal causa de demência na população idosa. O processamento da proteína precursora de amilóide (APP) pelas β- e g- secretases origina o peptídeo Aβ, que agrega em oligómeros neurotóxicos e em placas senis. Estes são eventos-chave na patogénese da DA que levam à rutura da neurotransmissão sináptica, morte neuronal e inflamação neuronal do hipocampo e córtex cerebral, causando perda de memória disfunção cognitiva geral. Apesar dos grandes avanços no conhecimento do papel do processamento da APP na DA, a sua função fisiológica ainda não foi totalmente elucidada. Os mapas de interações proteína-proteína (PPI) humanos têm desempenhado um papel importante na investigação biomédica, em particular no estudo de vias de sinalização e de doenças humanas. O método dois-híbrido em levedura (YTH) consiste numa plataforma para a produção rápida de redes de PPI em larga-escala. Neste trabalho foram realizados vários rastreios YTH com o objetivo de identificar proteínas específicas de cérebro humano que interagissem com a APP, ou com o seu domínio intracelular (AICD), tanto o tipo selvagem como com os mutantes Y687F, que mimetizam o estado desfosforilado do resíduo Tyr-687. De facto, a endocitose da APP e a produção de Aβ estão dependentes do estado de fosforilação da Tyr-687. Os rastreios YTH permitiram assim obter de redes proteínas que interagem com a APP, utilizando como “isco” a APP, APPY687F e AICDY687F. Os clones positivos foram isolados e identificados através de sequenciação do cDNA. A maior parte dos clones identificados, 118, correspondia a sequências que codificam para proteínas conhecidas, resultando em 31 proteínas distintas. A análise de proteómica funcional das proteínas identificadas neste estudo e em dois projetos anteriores (AICDY687E, que mimetiza a fosforilação, e AICD tipo selvagem), permitiram avaliar a relevância da fosforilação da Tyr-687. Três clones provenientes do rastreio YTH com a APPY687F foram identificados como um novo transcrito da proteína Fe65, resultante de splicing alternativo, a Fe65E3a (GenBank Accession: EF103274), que codifica para a isoforma p60Fe65. A p60Fe65 está enriquecida no cérebro e os seus níveis aumentam durante a diferenciação neuronal de células PC12, evidenciando o potencial papel que poderá desempenhar na patologia da DA. A RanBP9 é uma proteína nuclear e citoplasmática envolvida em diversas vias de sinalização celulares. Neste trabalho caracterizou-se a nova interação entre a RanBP9 e o AICD, que pode ser regulada pela fosforilação da Tyr-687. Adicionalmente, foi identificada uma nova interação entre a RanBP9 e a acetiltransferase de histonas Tip60. Demonstrou-se ainda que a RanBP9 tem um efeito de regulação inibitório na transcrição mediada por AICD, através da interação com a Tip60, afastando o AICD dos locais de transcrição ativos. O estudo do interactoma da APP/AICD, modelado pela fosforilação da Tyr-687, revela que a APP poderá estar envolvida em novas vias celulares, contribuindo não só para o conhecimento do papel fisiológico da APP, como também auxilia a revelar as vias que levam à agregação de Aβ e neurodegeneração. A potencial relevância deste trabalho relaciona-se com a descoberta de algumas interações proteicas/vias de sinalização que podem que podem ser relevantes para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas na DA.